Valutazione farmaco-tossicologica di un’acqua minerale termale in seguito ad esposizione sub acuta per via inalatoria

RIASSUNTO

La tossicità acuta per inalazione è l’insieme degli effetti causati da una sostanza inspirabile in seguito ad una singola ed ininterrotta esposizione per inalazione. Questo studio è una valutazione farmaco-tossicologica volta all’accertamento della completa innocuità di un’acqua minerale termale scaturente da un pozzo sito in località Cervia in seguito ad un’esposizione sub-acuta per via inalatoria. A tal fine le ricerche condotte, basate sulla OECD 412 “Subacute Inhalation Toxicity”, hanno previsto l’utilizzo di 20 ratti Wistar maschi (n=10) e femmine (n=10), divisi in due lotti e posti in quattro gabbie contenenti n° 5 animali ciascuna; il lotto n°1 è stato utilizzato come controllo, mentre il lotto n°2, detto trattato, veniva esposto ad i nalazione continua dell’acqua in esame. Al temine del periodo sperimentale, gli animali sono stati sacrificati dopo prelievo ematico massimale e i principali organi prelevati per l’analisi necroscopica.
I risultati delle nostre indagini evidenziano che la somministrazione sub cronica per via inalatoria dell’acqua minerale termale analizzata non determina alterazioni tossiche letali sulle funzioni metaboliche e sulla integrità degli organi da noi esaminati.
Sono state comunque riscontrate alcune anomalie morfo-funzionali associate ad una non perfetta funzionalità renale ed epatica, come evidenziato dai parametri ematoclinici e dalla descrizione di alcuni preparati istologici. Oltre a ciò, la valutazione del tratto respiratorio ha consentito di evidenziare segni di uno stato infiammatorio a livello di trachea e polmone.
Concludendo, alla luce delle informazioni disponibili dalla letteratura scientifica si ipotizza che le complicazioni sistemiche descritte dai parametri ematici e dall’ esame istologico di rene e fegato non siano attribuibili al trattamento in sé, quanto piuttosto ad una risposta generalizzata allo stress acustico generato dall’erogatore utilizzato; per contro, non è possibile escludere gli eventi infiltranti di tipo infiammatorio osservati in sezioni di trachea e polmone siano dovuti alla durata del trattamento piuttosto che alla composizione chimica dell’acqua in esame nebulizzata.

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AUTORI

  • S. Bianchini
  • L. Giovannini

PAROLE CHIAVE

  • Acqua termale
  • Valutazione farmaco-tossicologica
  • OECD 412

”Introduzione”

La tossicità acuta per inalazione è l’insieme degli effetti causati da una sostanza inspirabile in seguito ad una singola ed ininterrotta esposizione per inalazione. Per calcolare la tossicità acuta le dosi della sostanza da testare (almeno 3 dosi) devono essere somministrate entro le prime 24 ore. Dopo la somministrazione, si studia ed osserva l’animale per 15 giorni e si eseguono tutte le analisi volte ad una valutazione della tossicità. Tuttavia, gli effetti riscontrati nella tossicità acuta possono essere ben diversi da quelli legati ad esposizione a tossicità subacuta e/o cronica, dove si utilizzano dosi nettamente inferiori a quelle impiegate nella tossicità acuta, mentre il tempo di durata varia da 28 giorni a 2/3 anni. Gli studi volti a raccogliere informazioni sulla tossicità e sulle proprietà fisico-chimiche delle sostanze sono solitamente condotti sulla base di linee guide specifiche per la sperimentazione, ed in particolare sulle linee guida OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development). Le linee guida dell’OECD sono uno strumento unico per valutare i potenziali effetti delle sostanze chimiche sulla salute umana e sull’ambiente. Accettati a livello internazionale come metodi standard per le prove di sicurezza, le Linee Guida sono utilizzati da professionisti nel settore industriale, del mondo accademico e del governo coinvolti nella sperimentazione e alla valutazione delle sostanze chimiche (prodotti chimici industriali, pesticidi, prodotti per la cura personale, ecc.).

Queste linee guida sono regolarmente aggiornate con l’aiuto di migliaia di esperti nazionali dei paesi membri dell’OECD.
A tal proposito, la linea guida che riguarda la valutazione della tossicità per via inalatoria è l’OECD 412Subacute Inhalation Toxicity”.
Gli studi clinici e farmaco-tossicologici sono di notevole importanza anche per la valutazione delle caratteristiche cliniche e farmacologiche delle acque minerali naturali. Sono considerate acque minerali naturali le acque che, avendo origine da una falda o giacimento sotterraneo, provengono da una o più sorgenti naturali o perforate e che hanno caratteristiche igieniche particolari e, eventualmente, proprietà favorevoli alla salute.
Le acque minerali naturali si distinguono dalle ordinarie acque potabili per la purezza originaria e sua conservazione, per il tenore in minerali, oligoelementi e/o altri costituenti ed, eventualmente, per taluni loro effetti. D’altra parte, sono invece definite acque termali, le acque minerali naturali le cui particolari caratteristiche chimico – fisiche e batteriologiche le rende utilizzabili per fini terapeutici.
La cura termale deve essere comunque prescritta e somministrata sotto controllo medico e le aziende termali, in quanto strutture sanitarie  devono possedere i requisiti strutturali, tecnologici e di risorse umane, previsti dalla normativa vigente in materia.
Infatti, un’acqua minerale termale per essere considerata tale ed utilizzata a fini terapeutici, deve ottenere il riconoscimento da parte del Ministero della Salute che valuta gli studi geologici, le analisi batteriologiche e chimico-fisiche nonché le sperimentazioni clinico-farmacologiche e tossicologiche.
La commercializzazione deve essere quindi autorizzata dagli Enti competenti, dopo una serie di sopralluoghi, accertamenti sull’idoneità delle captazioni, degli impianti, valutazioni chimiche e farmaco-tossicologiche delle acque in esame.

Per questo, le disposizioni legislative relative alle acque minerali hanno origini molto lontane, le prime indicazioni risalgono, infatti, all’inizio del secolo scorso (Regio Decreto 45/190 e legge 947 del 16 luglio 1916) cui sono seguite le numerose norme che hanno regolamentato il settore.
In ambito comunitario, la materia è stata disciplinata dalla Direttiva 80/777/CEE, modificata dalla Direttiva 96/70/CE e recentemente sostituita dalla Direttiva di rifusione 2009/54/CE, recepita in Italia dal D.lgs. 105/1992.
Successivamente, la normativa comunitaria è intervenuta introducendo alcune novità, pur nella continuità e nel consolidamento dei dispositivi normativi nazionali.
In particolare la Direttiva 2003/40/CE è stata recepita in Italia con due successivi provvedimenti legislativi: i DD.MM. 11/09/2003 e 29/12/2003.

Le normative che si concentrano più specificatamente sulle acque minerali termali sono la legge n° 833 del 23 dicembre 1978 e la n°323 del 2000 che rappresenta quella principale di riferimento per le acque termali. Nelle normative citate vengono ben ribaditi i criteri di valutazione delle caratteristiche delle acque minerali naturali e termali. In particolare sono approfonditi i criteri di valutazione delle caratteristiche cliniche e farmacologiche di tali acque. E’ così messa in evidenza l’importanza di studi clinici e farmaco-tossicologici, eseguiti secondo metodi scientifici riconosciuti, presso strutture universitarie o aziende sanitarie o enti di ricerca pubblici o privati accreditati nel rispetto delle regole di buona pratica clinica e di buona pratica di laboratorio.

Il nostro studio si colloca in questo contesto e, seguendo le indicazioni delle suddette normative, si pone lo scopo di accertare la completa innocuità dell’acqua minerale termale in esame. Più precisamente, questo studio è una valutazione farmaco-tossicologica volta all’accertamento della completa innocuità di un’acqua minerale termale scaturente da un pozzo sito in località Cervia in seguito ad un’esposizione sub-acuta per via inalatoria

”Materiali e metodi”

Animali Le ricerche sono state condotte su 20 ratti Wistar adulti (Harlan, Italy) in perfetto benessere, in modo da poter ben evidenziare un’eventuale azione tossica ed anche disturbi dei normali processi metabolici. Sono stati utilizzati ratti Wistar con un peso compreso tra 200-300g di entrambi i sessi; a tal proposito test di tossicità acuta per via orale, inalatoria o cutanea mostrano come vi sia una differenza tra i due sessi e come le femmine siano generalmente più sensibili.

Condizioni di stabulazione e alimentazione All’arrivo in laboratorio gli animali sono stati posti in stabulazione in condizioni ambientali controllate ( temperatura 22 ± 3 ° C, umidità 50% e a cicli di 12 ore di luce/buio) con libero accesso al cibo e all’acqua. Gli animali sono stati alimentati con dieta standard MIL fornitaci dalla ditta Harlan, Italy. Ciascun animale è stato assegnato con metodo random ai gruppi sperimentali; più precisamente sono stati divisi in due lotti e posti in quattro gabbie contenenti 5 animali ciascuna; il lotto n°1 è stato utilizzato come controllo, mentre il lotto n°2, detto trattato, è stato esposto ad inalazione continua dell’acqua in esame come descritto successivamente.

Preparazione dell’animale e metodologia Gli animali sono stati acclimatati alle condizioni di laboratorio per almeno cinque giorni prima dell’inizio dello studio.

Le tecnica utilizzata per lo studio di tossicità acuta da inalazione ha previsto l’ esposizione dell’intero corpo degli animali. A tale scopo, durante la fase sperimentale gli animali sono stati alloggiati in numero di 5 per sesso in una camera collegata ad un apparecchio per la nebulizzazione dell’acqua in studio, in modo tale da garantire un numero minimo di 14-15 ricambi di aria per ora ed assicurare un adeguato apporto di ossigeno (circa 19%).
L’apparecchio utilizzato per l’inalazione (Nebucolor II della Ditta 3A Snc Sirmione –Brescia Italia) ha garantito un flusso di 7,5 L/min e la nebulizzazione di soluzioni in particelle del diametro di 2.7.MMAD (mass median aerodynamic diameter); il tempo di nebulizzazione è stato di circa 1.5 ml /10 min.
La procedura sopradescritta ha previsto la somministrazione della sostanza alla massima concentrazione ottenibile, per 6h e 5 giorni a settimana, durante un periodo sperimentale totale di 4 settimane.
Durante tale periodo, gli animali sono stati osservati almeno due volte al giorno al fine di riscontrare qualsiasi anomalia della cute e del pelo, occhi e mucose, attività respiratoria, circolatoria ed alterazioni nervose.
Al temine del periodo sperimentale, gli animali sono stati sacrificati dopo prelievo ematico massimale mediante puntura intracardiaca e i principali organi prelevati per l’analisi necroscopica.

Parametri ematici indagati Conta eritrocitaria; Ematocrito; Emoglobina volume medio corpuscolare; MHC (Mean corpuscular haemoglobin); MCV (Mean corpuscular volume); MCHC (Mean corpuscular haemoglobin concentration); Reticulocytes; Conta leucocitaria; Conta piastrinica; Tempo di Protrombina; Colesterolo Totale; Trigliceridi; Azotemia; Bilirubina totale; Creatinina; Proteine totali; Albumina;Globulina; Alanine amino transferasi; Aspartato amino transferasi; Fosfatasi Alcalina; Potassio; Sodio; Calcio; Fosforo; Cloro.

Organi analizzati Cuore, Reni, Fegato, Stomaco, Laringe, Faringe, Trachea, Esofago, Polmoni (tutti i lobi di un livello, compresi i bronchi principali; linfonodi della regione ilare del polmone); tessuto nasofaringeo (inclusi i dotti nasofaringei e il tessuto linfoide nasale (NALT))

”Analisi Statistica”

Il numero di animali necessari per lo studio è stato scelto sulla base delle nostre esperienze precedenti e delle linee guida e normative nazionali/comunitarie che regolamentano le acque minerali. E’ stato così scelto un numero di 20 animali, sufficiente per  ottenere un’analisi statistica adeguata e conforme all’obiettivo del progetto.  I risultati sono stati espressi come media±errore standard della media. La significatività delle differenze tra le medie sarà analizzata tramite test t di Student per dati non appaiati

”Risultati”

Azione sulla crasi ematica e sulle funzioni metaboliche Al termine del periodo sperimentale (4 settimane) è stato prelevato un campione di sangue da ciascun animale, mediante puntura intracardiaca, per l’esecuzione di esami emocitometrici ed ematochimici. In particolare, sono stati presi in considerazione quei parametri che potevano fornire informazioni sulle eventuali alterazioni sia della crasi ematica sia delle funzioni metaboliche. I risultati ottenuti nei due gruppi controllo (maschi e femmine) e trattati (maschi e femmine) sono riportati di seguito analiticamente e graficamente.
La Figura 1 (A/B/C/D) e le Figure 2 (A-E) e 3 (A-E) riportano i risultati degli esami emocromocitometrici eseguiti. In dettaglio, i valori sotto riportati evidenziano che i dati emocromocitometrici ottenuti negli animali trattati con l’acqua termale in esame e quelli ottenuti negli animali controllo rientrano nei limiti fisiologici per la specie in esame ed in entrambi i sessi, per cui posso considerarsi sovrapponibili.

 

Figura 1A

Figura 1A

 

Figura 1B

Figura 1B

 

Figura 1C

Figura 1C

 

Figura 1D

Figura 1D

Figura 1 (A/B/C/D): Esame Emocromocitometrico. Acqua controllo vs Acqua in Esame

 

Figura 2A

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Figura 2B

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Figura 2C

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Figura 2D

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Figura 2E

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Figura 2(A/B/C/D/E). Esame Emocromocitometrico. Acqua controllo vs Acqua in Esame in ratti Wistar maschi

 

Figura 3A

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Figura 3B

Figura 3B

 

Figura 3C

Figura 3C

 

Figura 3D

Figura 3D

 

Figura 3E

Figura 3E

Figura 3(A/B/C/D/E). Esame Emocromocitometrico. Acqua controllo vs Acqua in Esame in ratti Wistar femmine

Le Figure 4, 5 e 6 riportano i risultati degli esami riguardanti gli elettroliti ematici. In dettaglio, i risultati ematochimici (Fig. 4; Fig.5) ottenuti dai ratti Wistar di sesso maschile non evidenziano variazioni significative tra gli animali controllo e gli animali trattati e sono in accordo con i parametri fisiologici della specie in esame

Figura 4 - Elettroliti Ematici. Acqua controllo vs Acqua in Esame

Figura 4 – Elettroliti Ematici. Acqua controllo vs Acqua in Esame

 

Figura 5 - Elettroliti Ematici. Acqua controllo vs Acqua in Esame in ratti Wistar maschi

Figura 5 – Elettroliti Ematici. Acqua controllo vs Acqua in Esame in ratti Wistar maschi

Per quanto riguarda i dati ematochimici analizzati nei due gruppi sperimentali con femmine di ratto Wistar controllo o trattate con l’acqua in esame è, invece, riportata una riduzione significativa (p<0.05) dei livelli ematici di fosforo (Fig.6).

Figura 6 - Elettroliti Ematici. Acqua controllo vs Acqua in Esame in ratti Wistar femmine

Figura 6 – Elettroliti Ematici. Acqua controllo vs Acqua in Esame in ratti Wistar femmine

Aldilà della transitorietà o meno di questa riduzione, occorre sottolineare come tale dato sia associato a fenomeni quali iperparatiroidismo, ipovitaminosi D, osteomalacia, tubulopatie renali, malassorbimento intestinale, malnutrizione, ecc. Sulla base di quanto emerso dall’analisi istologica delle sezioni di rene, non è da escludere che le alterazioni tubulari riscontrate a livello midollare (Fig 15) siano proprio la causa di questa riduzione dei livelli ematici di fosforo.

Le Figure 7, 8 e 9 riportano tutti gli altri esami ematochimici eseguiti sul campione di sangue prelevato dagli animali, ed in dettaglio: coagulazione, bilirubina totale, transaminasi AST, ALT, fosfatasi alcalina, albumina, colesterolo, trigliceridi, azotemia, creatinina e proteine totali.

Figura 7A

Figura 7A

 

Figura 7B

Figura 7B

 

Figura 7(A/B). Esame Ematochimico. Acqua controllo vs Acqua in Esame

Dai dati sotto riportati si evidenzia come negli animali che hanno ricevuto il trattamento cronico con l’acqua in esame sono evidenziabili alcune modificazioni significative rispetto ai gruppi controllo:

  • nei maschi si osserva un aumento dei livelli ematici degli enzimi epatici ALT e Fosfatasi Alcalina (Fig. 8B; p<0.05), associata ad una riduzione dei Trigliceridi, delle Proteine Totali (Fig. 8C; p<0.05), mentre la variazione dei livelli di Creatinina plasmatica (Fig.8C; p<0.05) rientra ampliamente nei limiti fisiologici della specie;
  • nelle femmine viene confermato un aumento significativo dei livelli ematici dell’enzima epatico Fosfatasi Alcalina e Bilirubina Fig. 9B; p<0.05).
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Figura 8A

 

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Figura 8B

 

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Figura 8C

 

Figura 8 (A/B/C). Esame Ematochimico. Acqua controllo vs Acqua in Esame in ratti Wistar maschi

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Figura 9A

 

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Figura 9B

 

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Figura 9C

 

Figura 9 (A/B/C). Esame Ematochimico. Acqua controllo vs Acqua in Esame in ratti Wistar femmine

VALUTAZIONE MACROSCOPICA

10 ratti maschi e 10 ratti femmine Wistar sono stati divisi in due lotti e posti in quattro gabbie contenenti 5 animali ciascuna; il lotto n°1 è stato utilizzato come controllo, mentre il lotto n°2, detto trattato, è stato esposto ad inalazione continua dell’acqua in esame come descritto.
Dopo 4 settimane gli animali sono stati sacrificati per dissanguamento ed è stata eseguita la valutazione macroscopica degli organi.
A questo proposito, gli organi analizzati sono stati: Cuore, Reni, Fegato, Stomaco, Laringe, Faringe, Trachea, Esofago, Polmoni (tutti i lobi di un livello, compresi i bronchi principali; linfonodi della regione ilare del polmone); tessuto nasofaringeo (inclusi i dotti nasofaringei e il tessuto linfoide nasale (NALT)).
In aggiunta, campioni di rene, fegato e cuore sono stati inclusi in paraffina per effettuare l’esame istologico microscopico.
L’esame istologico non ha rilevato alterazioni morfologiche dell’organo e della sua trama istologica attribuibili al trattamento prolungato con l’acqua in esame a livello del cuore e stomaco ( Fig. 10-13).

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Figura 10 (A/B). Cuore di ratto controllo (40X): maschio(A), femmina (B)

 

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Figura 11 (C/D). Cuore di ratto trattato con l’acqua in esame (40X) ): maschio (C) e femmina (D)

 

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Figura 12 (A/B). Immagine macroscopica della mucosa gastrica di un ratto controllo maschio (A) e femmina (B)

 

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Figura 13 (C/D). Immagine macroscopica della mucosa gastrica di un ratto trattato con l’acqua in esame maschio (C) e femmina (D)

 

A livello renale ( Fig.14-15) è stata evidenziata, in alcune sezioni degli animali trattati con l’acqua in esame, una sofferenza tubulare soprattutto a livello midollare (Fig.15).

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Figura 14 (A/B). Rene di ratto controllo (40X): maschio (A) e femmina (B)

 

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Figura 15 (C/D/E). Rene di ratto trattato con l’acqua in esame (40X): maschio (C) e femmina (D). Sezione della zona porzione (E)

 

A livello epatico (Fig. 16-17) si segnala, invece, la presenza di infiltrati cellulari a carico del tratto portale nelle sezioni istologiche degli animali sottoposti al trattamento (Fig.17 C/D).   Si ritiene che tali alterazioni siano da attribuirsi ad un danno da stress acustico prolungato [18,19] e non alla somministrazione dell’acqua in studio.

Figura 16 (A/B/C/D). Fegato di ratto controllo (40X): sezione triade portale (A: maschio ,B: femmina) e centro lobulare (C: maschio, D: femmina)

Figura 16 (A/B/C/D). Fegato di ratto controllo (40X): sezione triade portale (A: maschio ,B: femmina) e centro lobulare (C: maschio, D: femmina)

 

Figura 17 (A/B/C/D). Fegato di ratto tratto con l’acqua in esame (40X): sezione triade portale (A: maschio ,B: femmina) e centro lobulare (C: maschio, D: femmina). Nelle sezioni C e D è evidenziabile una cellularità ulteriore di probabile natura infiammatoria

Figura 17 (A/B/C/D). Fegato di ratto tratto con l’acqua in esame (40X): sezione triade portale (A: maschio ,B: femmina) e centro lobulare (C: maschio, D: femmina). Nelle sezioni C e D è evidenziabile una cellularità ulteriore di probabile natura infiammatoria

 

In merito alle porzioni di tessuto respiratorio prelevato a vari livelli, non sono state rilevate differenze tra i gruppi controllo e trattato con acqua in oggetto a livello di mucosa nasale (Fig.18 -19),  faringe (parte terminale) e laringe

Figura 18 (A/B). Mucosa nasale di ratto controllo (40X): maschio (A) e femmina (B)

Figura 18 (A/B). Mucosa nasale di ratto controllo (40X): maschio (A) e femmina (B)

 

Figura 19 (A/B). Mucosa nasale di ratto trattato con l’acqua in esame (40X): maschio (C) e femmina (D)

Figura 19 (A/B). Mucosa nasale di ratto trattato con l’acqua in esame (40X): maschio (C) e femmina (D)

Tuttavia sono state riscontrate alcune importanti alterazioni della trama tissutale sia a livello del polmone che della trachea: in particolare, nel tessuto polmonare gli animali trattati presentano aree di addensamento nelle regioni periferiche dell’organo, nella trachea gli animali trattati presentano un modesto infiltrato linfocitario che interessa solo parzialmente il perimetro dell’organo (Fig. 20). Tali alterazioni sono viceversa attribuibili al trattamento inalatorio sub acuto

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Figura 20 (A/B/C/D). Trachea di ratto trattato con l’acqua in esame(40X): maschio (A, B) e femmina (C,D)

”Conclusioni”

Il presente studio, seguendo le indicazioni della normativa OECD 412 “Subacute Inhalation Toxicity”, linea guida fondamentale nella valutazione della tossicità di una sostanza in seguito ad un’esposizione per via inalatoria, si pone lo scopo di accertare la completa innocuità dell’acqua minerale termale in esame. I risultati delle nostre indagini evidenziano che la somministrazione  per via inalatoria dell’acqua termale in esame non determina alterazioni tossiche letali  sulle funzioni metaboliche e sulla integrità degli organi da noi esaminati. Sono state comunque riscontrate alcune anomalie morfo-funzionali associate ad una non perfetta funzionalità renale ed epatica, come evidenziato dai parametri ematoclinici e dalla descrizione di alcuni preparati istologici. Oltre a ciò, la valutazione del tratto respiratorio ha consentito di  evidenziare segni di uno stato infiammatorio a livello di trachea e polmone. Tuttavia, per una corretta interpretazione dei risultati ottenuti è comunque importante sottolineare che le condizioni sperimentali hanno previsto un’esposizione continua e prolungata all’acqua in esame nebulizzata tramite lo strumento in dotazione, condizioni non corrispondenti a quelle utilizzate nei protocolli standard di Terapia Inalatoria effettuata presso le strutture termali o in ambiente domestico con nebulizzatori per aereosol commerciali. Concludendo, alla luce delle informazioni disponibili dalla letteratura scientifica si può  ipotizzare che le complicazioni sistemiche descritte dai parametri ematici e dall’ esame istologico di rene e fegato non siano attribuibili al trattamento in sé, quanto piuttosto ad una risposta generalizzata allo stress acustico generato dall’erogatore utilizzato; per contro, non è possibile escludere gli eventi infiltranti di tipo infiammatorio osservati in sezioni di trachea e polmone siano dovuti alla durata del trattamento piuttosto che alla composizione chimica dell’acqua in esame nebulizzata.

”Bibliografia”

Regio Decreto 29 luglio 1927, n. 1443. Norme di carattere legislativo per disciplinare la ricerca e la coltivazione delle miniere nel Regno.
Decreto del Presidente della Repubblica 14 gennaio 1972, n. 2. Trasferimento alle Regioni a statuto ordinario delle funzioni amministrative statali in materia di acque minerali e termali,di cave e torbiere e di artigianato e del relativo personale.
Decreto del Presidente della Repubblica 24 maggio 1988 n. 236. “Attuazione della direttiva 80/778/CEE concernente la qualità delle acque destinate al consumo umano, ai sensi dell’art. 15 della L. 16 aprile 1987, n. 183”.
Decreto legislativo 4 agosto 1999, n. 339. Disciplina delle acque di sorgente e modificazioni al D. Lgs. 25 gennaio 1992, n. 105, concernente le acque minerali naturali, in attuazione della direttiva 96/70/CE.
Direttiva 80/778/CEE del Consiglio, del 3 novembre 1998 concernente la qualità delle acque destinate al consumo umano.
Direttiva 98/83/CE del 3 novembre 1998 concernente la qualità delle acque destinate al consum oumano.
Decreto Ministeriale 11 settembre 2003. Attuazione della direttiva 2003/40/CE della Commissione nella parte relativa all’etichettatura delle acque minerali e delle acque di sorgente.
Decreto Ministeriale 29 dicembre 2003. Attuazione della direttiva 2003/40/CE della Commissione nella parte relativa ai criteri di valutazione delle caratteristiche delle acque minerali naturali di cui al D.M. 12 novembre 1992, n. 542, e successive modificazioni, nonchè alle condizioni di utilizzazione dei trattamenti delle acque minerali naturali e delle acque di sorgente.
Decreto legislativo 3 aprile 2006, n. 152. Norme in materia ambientale.
Temporelli G., Mantelli F. “Acque potabili e minerali naturali: le nuove disposizioni di legge in riferimento ai parametri chimici”. L’ACQUA, Rivista bimestrale dell’Associazione Idrotecnica Italiana, 4, pag. 53-61,luglio-agosto 2004.
Costituzione della Repubblica Italiana.
Decreto Ministeriale 10 febbraio 2015. Criteri di valutazione delle caratteristiche delle acque minerali naturali.

Legge n°833 del 23 Dicembre 1987. Istruzione del Servizio Sanitario Nazionale
Legge 24 ottobre 2000 n. 323. Riordino del settore termale.
OECD (2009), Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
OECD (2009), OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS. Subacute Inhalation Toxicity: 28-Day Study. Original Test Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris.
Breschi MC, Scatizzi R, Martinotti E, Pellegrini A, Soldani P, Paparelli A. Morphofunctional changes in the noradrenergic innervation of the rat cardiovascular system after varying duration of noise stress. Int J Neurosci. 1994 Mar;75(1-2):73-81.
Gao S, Han X, Fu J, Yuan X, Sun X, Li Q. Influence of chronic stress on the compositions of hepatic cholesterol and triglyceride in male Wistar rats fed a high fat diet. Hepatol Res. 2012 Jul;42(7):686-95

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