Valutazione farmaco-tossicologica di un’acqua calda-ipotermale in seguito ad esposizione cutanea

RIASSUNTO

Un’acqua minerale termale per essere considerata tale ed utilizzata a fini terapeutici, deve possedere delle caratteristiche cliniche e farmacologiche ben precise, rispettando i criteri richiesti dalle normative nazionali e comunitarie. Questo studio è una valutazione farmaco-tossicologica volta all’accertamento della completa innocuità di un’acqua calda-ipotermale scaturente da un pozzo sito in Bolzano in seguito ad un’esposizione cutanea o contatto per fini terapeutici. A tal fine le ricerche condotte si basano sulla OECD 434Acute dermal toxicity”, linea guida fondamentale nella valutazione della tossicità di una sostanza in seguito ad esposizione cutanea. Questo lavoro si inserisce in un progetto il cui obiettivo finale è quello di individuare, conoscere e sperimentare le caratteristiche medicali e curative a favore delle patologie cutanee delle acque “calde-ipotermali”.
Le ricerche sono state condotte su 5 ratti Wistar femmine opportunamente trattati con l’acqua calda ipotermale in esame, applicata uniformemente su circa il 10% della superficie corporea totale e tenuta a contatto con la pelle mediante una garza porosa e un cerotto non irritante per un periodo di esposizione di 24 ore. Gli animali sono stati osservati subito dopo la somministrazione ed almeno una volta durante i primi 30 minuti e quindi periodicamente nelle prime 24 ore, con una particolare attenzione durante le prime 4/5 ore, da allora in poi ogni giorno, per un totale di 14 giorni. Le osservazioni hanno incluso le eventuali variazioni del peso corporeo, le alterazioni della cute e del pelo, degli occhi e delle mucose, del sistema respiratorio, circolatorio, nervoso autonomo e centrale, dell’attività somatomotoria e nel comportamento.
Particolare attenzione è stata rivolta all’osservazione di tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma. Tutti gli animali sono stati sottoposti a necroscopia macroscopica. I risultati delle nostre indagini evidenziano che la somministrazione per via cutanea dell’acqua calda ipotermale scaturente dal sito posto in Bolzano non determina alterazioni tossiche letali sulle funzioni metaboliche e sulla integrità degli organi da noi esaminati.

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AUTORI

  • S. Bianchi
  • E. Cervadoro
  • L. Giovannini

PAROLE CHIAVE

  • Acqua termale
  • Valutazione farmaco-tossicologica
  • Patologie cutanee

”Introduzione”

Sono considerate acque minerali naturali le acque che, avendo origine da una falda o giacimento sotterraneo, provengono da una o più sorgenti naturali o perforate e che hanno caratteristiche igieniche particolari e, eventualmente, proprietà favorevoli alla salute. Le acque minerali naturali si distinguono dalle ordinarie acque potabili per la purezza originaria e sua conservazione, per il tenore in minerali, oligoelementi e/o altri costituenti ed, eventualmente, per taluni loro effetti. D’altra parte, sono invece definite acque termali, le acque minerali naturali le cui particolari caratteristiche chimico – fisiche e batteriologiche le rende utilizzabili per fini terapeutici.
La cura termale deve essere comunque prescritta e somministrata sotto controllo medico e le aziende termali, in quanto strutture sanitarie  devono possedere i requisiti strutturali, tecnologici e di risorse umane, previsti dalla normativa vigente in materia.
Infatti, un’acqua minerale termale per essere considerata tale ed utilizzata a fini terapeutici, deve ottenere il riconoscimento da parte del Ministero della Salute che valuta gli studi geologici, le analisi batteriologiche e chimico-fisiche nonché le sperimentazioni clinico-farmacologiche e tossicologiche. La commercializzazione deve essere quindi autorizzata dagli Enti competenti, dopo una serie di sopralluoghi, accertamenti sull’idoneità delle captazioni, degli impianti, valutazioni chimiche e farmaco-tossicologiche delle acque in esame.
Per questo, le disposizioni legislative relative alle acque minerali hanno origini molto lontane, le prime indicazioni risalgono, infatti, all’inizio del secolo scorso (Regio Decreto 45/190 e legge 947 del 16 luglio 1916) cui sono seguite le numerose norme che hanno regolamentato il settore. In ambito comunitario, la materia è stata disciplinata dalla Direttiva 80/777/CEE, modificata dalla Direttiva 96/70/CE e recentemente sostituita dalla Direttiva di rifusione 2009/54/CE, recepita in Italia dal D.lgs. 105/1992. Successivamente, la normativa comunitaria è intervenuta introducendo alcune novità, pur nella continuità e nel consolidamento dei dispositivi normativi nazionali.

In particolare la Direttiva 2003/40/CE è stata recepita in Italia con due successivi provvedimenti legislativi: i DD.MM. 11/09/2003 e 29/12/2003. Le normative che si concentrano più specificatamente sulle acque minerali termali sono la legge n° 833 del 23 dicembre 1978 e la n° 323 del 2000 che rappresenta quella principale di riferimento per le acque termali. Nelle normative citate vengono ben ribaditi i criteri di valutazione delle caratteristiche delle acque minerali naturali e termali.

In particolare sono approfonditi i criteri di valutazione delle caratteristiche cliniche e farmacologiche di tali acque. E’ così messa in evidenza l’importanza di studi clinici e farmaco-tossicologici, eseguiti secondo metodi scientifici riconosciuti, presso strutture universitarie o aziende sanitarie o enti di ricerca pubblici o privati accreditati nel rispetto delle regole di buona pratica clinica e di buona pratica di laboratorio. Il nostro studio si colloca in questo contesto e , seguendo le indicazioni delle suddette normative, si pone lo scopo di accertare la completa innocuità dell’acqua minerale termale in esame.
Più precisamente, questo studio è una valutazione farmaco-tossicologica volta all’accertamento della completa innocuità di un’acqua calda-ipotermale scaturente da un pozzo sito in Bolzano in seguito ad un’esposizione cutanea o contatto per fini terapeutici. A tal fine le ricerche condotte si basano sulla OECD 434Acute dermal toxicity”, linea guida fondamentale nella valutazione della tossicità di una sostanza in seguito ad esposizione cutanea. Questo lavoro si inserisce in un progetto il cui obiettivo finale è quello di individuare, conoscere e sperimentare le caratteristiche medicali e curative a favore delle patologie cutanee delle acque “calde- ipotermali

”Materiali e metodi”

Animali
Le ricerche sono state condotte su ratti 5 Wistar femmine (Harlan, Italy) in perfetto benessere, in modo da poter ben evidenziare un’eventuale azione tossica ed anche disturbi dei normali processi metabolici. Sono stati utilizzati ratti Wistar femmina perché studi precedenti e le linee guida OECD li indicano come la specie e il sesso più appropriato per questo tipo di studi. Infatti, test di tossicità acuta per via orale, inalatoria o cutanea mostrano come vi sia una differenza tra i due sessi e come le femmine siano generalmente più sensibili e quindi raccomandate per questo tipo di test.

Condizioni di stabulazione e alimentazione
All’arrivo in laboratorio gli animali sono stati posti in stabulazione in condizioni ambientali controllate ( temperatura 22 ± 3 ° C, umidità 50% e a cicli di 12 ore di luce/buio) con libero accesso al cibo e all’acqua. Gli animali sono stati alimentati con dieta standard MIL fornitaci dalla ditta Harlan, Italy. Ogni animale è stato alloggiato in una gabbia per non impedire la corretta osservazione di ciascun esemplare.

Preparazione dell’animale e metodologia
Gli animali sono stati acclimatati alle condizioni di laboratorio per almeno cinque giorni prima dell’inizio dello studio.
24 ore prima dello studio gli animali sono stati opportunamente preparati per l’esperimento e, a tal fine, è stato rimosso il pelo dalla zona dorsale del tronco, prestando attenzione a non ledere la pelle in modo da non causare nessuna alterazione della permeabilità. Per decidere la zona da preparare e le dimensioni della zona da coprire con la sostanza da testare è stato tenuto in considerazione il peso di ogni singolo animale. L’acqua calda ipotermale è stata applicata uniformemente su una superficie che è circa il 10% della superficie corporea totale e è stata tenuta a contatto con la pelle con una garza porosa e un cerotto non irritante per un periodo di esposizione di 24 ore. La zona utilizzata per il test è stata coperta in maniera idonea in modo da mantenere ferma la garza e assicurare che gli animali non ingerissero la sostanza in esame (Fig. 1-2). Alla fine del periodo di esposizione, la sostanza è stata rimossa usando acqua normale a temperatura ambiente.
Gli animali sono stati osservati subito dopo la somministrazione ed almeno una volta durante i primi 30 minuti e quindi periodicamente nelle prime 24 ore, con una particolare attenzione durante le prime 4/5 ore, da allora in poi ogni giorno, per un totale di 14 giorni. A questo proposito, i tempi in cui i segni di tossicità appaiono e scompaiono sono importanti, soprattutto se vi è una tendenza a manifestare segni di tossicità ritardata .
Tutte le osservazioni sono state sistematicamente registrate, con schede individuali per ogni animale. Gli animali sono stati inoltre pesati prima e dopo il trattamento e con cadenza giornaliera, per verificare un’eventuale influenza della sostanza testata sull’andamento ponderale.
Le osservazioni hanno incluso le alterazioni della cute e del pelo, degli occhi e delle mucose, del sistema respiratorio, circolatorio, nervoso autonomo e centrale, dell’attività somatomotoria e nel comportamento. Particolare attenzione è stata rivolta all’osservazione di tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma.
Tutti gli animali sono stati sottoposti a necroscopia macroscopica. L’esame microscopico non è stato preso in considerazione dato che non si sono presentate alterazioni patologiche evidenti degli organi.

Figura 1. Topo 2 nella fase di preparazione al trattamento ( PRE-TRATTAMENTO) e durante il trattamento (IN TRATTAMENTO)

Figura 1. Topo 2 nella fase di preparazione al trattamento ( PRE-TRATTAMENTO) e
durante il trattamento (IN TRATTAMENTO)

 

Figura 2. Topo 3 nella fase di preparazione al trattamento ( PRE-TRATTAMENTO) e durante il trattamento (IN TRATTAMENTO)

Figura 2. Topo 3 nella fase di preparazione al trattamento ( PRE-TRATTAMENTO) e
durante il trattamento (IN TRATTAMENTO)

”Analisi statistica”

Il numero di animali necessari per lo studio è stato scelto sulla base delle nostre esperienze precedenti e delle linee guida e normative nazionali/comunitarie che regolamentano le acque minerali. E’ stato così scelto un numero di 5 animali, sufficiente per  ottenere un’analisi statistica adeguata e conforme all’obiettivo del progetto.  I risultati sono stati espressi come media±errore standard della media. La significatività delle differenze tra le medie sarà analizzata tramite test t di Student per dati non appaiati.

”Risultati”

Variazioni peso corporeo Gli animali sono stati pesati prima e dopo il trattamento e con cadenza giornaliera, per verificare un’eventuale influenza della sostanza testata sull’andamento ponderale. La tabella 1 evidenzia i pesi registrati per ogni singolo topo. Come si può osservare non sono riportate variazioni significative del peso corporeo.

Tabella 1 - eso corporeo ratti

Tabella 1 – eso corporeo ratti

Osservazioni Gli animali sono stati osservati subito dopo la somministrazione ed almeno una volta durante i primi 30 minuti e quindi periodicamente nelle prime 24 ore, con una particolare attenzione durante le prime 4/5 ore, da allora in poi ogni giorno, per un totale di 14 giorni. A questo proposito, i tempi in cui i segni di tossicità appaiono e scompaiono sono importanti, soprattutto se vi è una tendenza a manifestare segni di tossicità ritardata .
Tutte le osservazioni sono state sistematicamente registrate, con schede individuali per ogni animale. Le osservazioni hanno incluso le alterazioni della cute e del pelo, degli occhi e delle mucose, del sistema respiratorio, circolatorio, nervoso autonomo e centrale, dell’attività somatomotoria e nel comportamento. Particolare attenzione è stata rivolta all’osservazione di tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma.

Come si può osservare dalle schede sotto riportate ( ratto 1-ratto 5) non sono state evidenziate
alterazioni significative o degne di nota per nessun animale.

 

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Valutazione macroscopica Il 14° giorno dopo essere stati osservati e valutati per l’eventuale presenza di alterazioni fisico
comportamentali, gli animali sono stati sottoposti a valutazione macroscopica. Ciascun ratto è stato anestetizzato e sacrificato mediante overdose da anestetico (Zoletil 100- 50mg/kg). E’ stato a questo punto valutato lo stato dei principali organi vitali: cuore, reni, polmoni, fegato, intestino e stomaco. La valutazione macroscopica, come mostrato in tabella 2, degli organi non ha messo evidenza nessuna alterazione patologica degna di nota.

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”Conclusioni”

Il presente studio, seguendo le indicazioni della normativa OECD 434Acute dermal toxicity”, linea guida fondamentale nella valutazione della tossicità di una sostanza in seguito ad esposizione cutanea, si pone lo scopo di accertare la completa innocuità dell’acqua minerale termale in esame. Più precisamente, questo studio è una valutazione farmaco-tossicologica volta  all’accertamento della completa  innocuità di un’acqua calda-ipotermale  scaturente da un  pozzo sito in  Bolzano in seguito ad un’esposizione cutanea  o contatto per  fini terapeutici. Questo lavoro si inserisce in un progetto il cui obiettivo finale  è quello di individuare, conoscere e sperimentare le caratteristiche medicali e curative a favore delle patologie cutanee delle acque “calde- ipotermali”. I risultati delle nostre indagini evidenziano che l’esposizione cutanea all’acqua termale in esame non causa nessuna alterazione né a livello comportamentale/somatomotore  né sulle funzioni metaboliche e sulla integrità degli organi da noi esaminati. In particolare non sono state osservate alterazioni a livello cutaneo, irritazioni o segni di tossicità in seguito al contatto.

”Bibliografia”

Regio Decreto 29 luglio 1927, n. 1443. Norme di carattere legislativo per disciplinare la ricerca e la coltivazione delle miniere nel Regno.
Decreto del Presidente della Repubblica 14 gennaio 1972, n. 2. Trasferimento alle Regioni a statuto ordinario delle funzioni amministrative statali in materia di acque minerali e termali,di cave e torbiere e di artigianato e del relativo personale.
Decreto del Presidente della Repubblica 24 maggio 1988 n. 236. “Attuazione della direttiva 80/778/CEE concernente la qualità delle acque destinate al consumo umano, ai sensi dell’art. 15 della L. 16 aprile 1987, n. 183”.
Decreto legislativo 4 agosto 1999, n. 339. Disciplina delle acque di sorgente e modificazioni al D. Lgs. 25 gennaio 1992, n. 105, concernente le acque minerali naturali, in attuazione della direttiva 96/70/CE.
Direttiva 80/778/CEE del Consiglio, del 3 novembre 1998 concernente la qualità delle acque destinate al consumo umano.
Direttiva 98/83/CE del 3 novembre 1998 concernente la qualità delle acque destinate al consum oumano.
Decreto Ministeriale 11 settembre 2003. Attuazione della direttiva 2003/40/CE della Commissione nella parte relativa all’etichettatura delle acque minerali e delle acque di sorgente.
Decreto Ministeriale 29 dicembre 2003. Attuazione della direttiva 2003/40/CE della Commissione nella parte relativa ai criteri di valutazione delle caratteristiche delle acque minerali naturali di cui al D.M. 12 novembre 1992, n. 542, e successive modificazioni, nonchè alle condizioni di utilizzazione dei trattamenti delle acque minerali naturali e delle acque di sorgente.
Decreto legislativo 3 aprile 2006, n. 152. Norme in materia ambientale.
Temporelli G., Mantelli F. “Acque potabili e minerali naturali: le nuove disposizioni di legge in riferimento ai parametri chimici”. L’ACQUA, Rivista bimestrale dell’Associazione Idrotecnica Italiana, 4, pag. 53-61,luglio-agosto 2004.

Costituzione della Repubblica Italiana.
Decreto Ministeriale 10 febbraio 2015. Criteri di valutazione delle caratteristiche delle acque minerali naturali.
Legge n°833 del 23 Dicembre 1987. Istruzione del Servizio Sanitario Nazionale
Legge 24 ottobre 2000 n. 323. Riordino del settore termale.
OECD (1987). OECD Guideline for Testing of Chemicals: Acute Dermal Toxicity 402.
OECD (2004), OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS. Acute Dermal Toxicity – Fixed Dose Procedure.

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